□黄金峰 李厚诚 韩博 孙东晓
瘤胃是成年奶牛的主要消化吸收器官，能够降解粗饲料、非蛋白氮等饲料。微生物大量存在于瘤胃，其组成、丰度、功能和代谢会影响奶牛的产奶和饲料转化效率等性状。本文介绍了宏基因组技术在微生物基因组组装、瘤胃微生物调控奶牛生产性状形成机制以及微生物新酶发现的研究进展，展望了奶牛瘤胃宏基因学发展前景，旨在为解析奶牛重要性状遗传与调控机制提供新思路。
瘤胃微生物基因组
奶牛瘤胃微生物丰富复杂，每毫升瘤胃液包含高达10 个细菌、10 —10 个真菌、10 —10 个原虫和10 个古细菌。传统的瘤胃微生物研究方法是利用纯培养技术分离并进行二代测序。Seshadri等对410种培养分离的瘤胃微生物进行Illumina与PacBio测序，成功构建了480个细菌和21个古细菌基因组集，但缺少真菌或原虫完整的基因组。由于微生物数量种类众多，许多微生物难以被分离培养，其基因组也难以被获取，因此利用常规方法研究瘤胃微生物的效率较低。
宏基因组学是对生境中所有微生物的遗传信息进行研究的方法，该方法可以突破纯培养分离的限制。宏基因组学的发展使得科研人员可以直接利用宏基因组测序数据组装高完整性的微生物基因组（MAG），从而更高效地鉴定细菌和古细菌及其丰度。有研究认为，许多未培养分离的细菌物种在脂质代谢中起着关键作用。2004年Tyson等基于宏基因组技术组装了2个几乎完整的微生物基因组。2011年Hess等将分箱技术运用于宏基因组组装，组装了15个未培养分离的微生物基因组，完整性达到60%以上。2018年，Stewart等对43头苏格兰牛的瘤胃液进行宏基因组测序并组装了913个高质量细菌和古细菌基因组，对未培养分离的MAG中69678个具有碳水化合物活性功能的序列进行蛋白质预测，发现91.3%是具有碳水化合物活性的新酶；2019年，该团队又基于283头阿伯丁安格斯、利木赞、夏洛来和Luing牛，利用瘤胃宏基因组技术组装了4941个基因组，其中3535个可能为潜在新物种。2021年，Xie等利用370个奶牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、狍子和鹿的胃肠道微生物样本进行宏基因组分析，组装了10373个基因组，鉴定出8745个未培养分离的物种；通过分析未培养分离的MAG数据发现主要影响饲料转化效率和甲烷代谢，可以为减少胃肠道产甲烷提供新的研究靶点。Xue等利用49头荷斯坦奶牛的宏基因组组装和单细胞RNA测序，获得了186个MAGs，揭示了拟杆菌门在瘤胃碳水化合物降解中发挥重要作用，并发现了参与纤维素消化的关键MAGs；联合分析发现，MAG对瘤胃上皮细胞亚型的关键基因表达起调控作用，可能调控乳脂肪酸代谢。尽管通过MAG能够发现新的参与代谢的关键微生物、酶基因和调控网络，但这些研究仍然缺乏完整的真核生物或病毒基因组，需要进一步发展与完善。
目前常用的宏基因组组装工具有Megahit、MetaSP Ades、IDBA-UD、SPAdes、RayMeta、MetAMOS、MOCAT2、Anvi'o、Canu、metaFlye、wtdbg2和NECAT等。其中，MaSuRCA和MetaSPAdes组装的准确性最高，Megahit对于计算资源的需求最小。基于宏基因组组装的微生物基因组主要依靠标记基因来评估完整性和污染性，例如CheckM。有研究者仍然认为通过宏基因组技术获得的微生物基因组对微生物的生长、代谢、生理等生物特征的解析并不准确，只有培养分离新的微生物才能解析微生物在自然环境中的作用等问题。但宏基因组组装依旧是目前获得微生物基因组最可行的方法。
奶牛瘤胃微生物酶
奶牛瘤胃微生物合成的各种酶类可以促进对所采食饲料的消化，从而影响产奶等性状，目前主要集中在糖苷酶、酯酶和脂肪酶。利用宏基因组技术鉴定并了解奶牛瘤胃微生物相关的酶类可为解析瘤胃微生物调控重要性状的形成的机制提供新思路。
1、糖苷酶
纤维素是植物细胞壁中最丰富的多糖，需要被降解为单糖才能更好地被奶牛等反刍动物利用。纤维素的降解需要糖苷酶（Glycoside Hydrolases，GH）中的内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶协同作用完成。通过宏基因组技术发现，不同糖苷酶家族在高低乳蛋白量和产奶量奶牛中差异显著。此外，糖苷酶对乳蛋白和乳脂可能有调控作用，在高低乳蛋白率和乳脂率奶牛中，11种糖苷酶家族存在显著差异。研究发现GH48家族纤维素酶在植物细胞壁多糖降解中起关键作用，GH5、GH9家族在瘤胃纤维素消化中丰度高，草料-酶存在互作。通过饲喂试验发现，糖苷酶对产奶性状和饲料转化效率具有显著影响。日粮中添加外源纤维素酶和木聚糖酶可提高奶牛产奶量和饲料转化效率。在泌乳中期奶牛日粮中添加β-葡聚糖酶和木聚糖酶，能提高饲料转化效率。也有研究发现添加外源酶不能显著影响产奶和饲料转化效率。利用宏基因组技术，研究者们新发现许多纤维素酶和木聚糖酶。
2、脂肪酶和酯酶
瘤胃脂质代谢在调节微生物细胞以及奶牛乳脂性状起着重要作用。迄今为止，仅从瘤胃液中培养分离出6个厌氧脂解细菌。2004年，Handelsman详细介绍了利用宏基因组发现酶基因的进展。Nagarajan利用宏基因组技术发现了许多新的合成脂肪酶和酯酶家族的细菌。
瘤胃微生物对
产奶性状和饲料转化效率的影响
1、产奶性状
选择具有极端高和极端低性状表型的奶牛个体，利用宏基因组技术分析瘤胃微生物与表型的关联，可以鉴定影响该性状的微生物种类及功能。拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）和变形菌（Butyrivibrio）是瘤胃微生物中3个主要的门，且厚壁菌与拟杆菌的相对丰度会影响人类和小鼠体内脂肪的生成。在奶牛上，厚壁菌与拟杆菌的比率和乳脂量密切相关。Wu等研究发现，在高乳脂率和乳蛋白率奶牛中，种水平上普雷沃菌属（Prevotella）的ruminicola、P6B4等13种微生物丰度较低乳脂率和低乳蛋白率奶牛显著提高，普雷沃菌属的KH2C16等25种微生物丰度较低；联合分析发现Neocallimastixcaliforniae、普雷沃菌属的ne3005和tc3-28与挥发性脂肪酸和乙酸呈正相关，参与了碳水化合物、氨基酸、丙酮酸、胰岛素、脂质代谢和运输代谢途径。Xue等选择40头荷斯坦奶牛进行研究发现，琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）等多种瘤胃微生物群可能对奶牛乳蛋白量和产奶量具有潜在作用。Xue等进一步对10头高产奶量和高乳蛋白量（HH）和10头低产奶量和低乳蛋白量（LL）通过宏基因组研究发现，种水平上38种细菌和14种古细菌在2组中存在显著差异，HH中普雷沃菌属11种微生物丰度显著较高，且5种与支链氨基酸、瘤胃氨基酸和血清氨基酸代谢功能相关，对奶牛乳蛋白量和产奶量具有潜在调控作用。
关于瘤胃普雷沃菌，有研究发现其与乳脂量呈显著负相关，但与产奶量呈正相关。近期有研究发现在种水平上，8种普雷沃菌与乳脂率和乳蛋白率密切相关并预测了对乳蛋白和脂肪合成的潜在调控机制。也有研究发现普雷沃菌属可能对乙酸盐、丙酸盐和戊酸盐浓度进行调控，但与乳蛋白量和产奶量关联不显著，进一步研究发现普雷沃菌属中5种微生物可能对乳蛋白量进行调控。除了多组学数据分析，研究人员通过进一步饲喂奶牛含有差异普雷沃菌菌种的酶制剂，验证其对奶牛生产性状的影响。
2、饲料转化效率
通过宏基因组技术，Auffret等对72头肉牛进行研究发现，K01840、K02005等8种微生物基因解释了饲料转化效率39%的变异性，属级水平上乳酸杆菌、双歧杆菌等45种微生物与饲料转化效率显著相关，有益菌可以直接接触或通过代谢物间接影响饲料转化效率。Lima等通过偏最小二乘法发现K03783、K08138等20种基因能够解释饲料转化效率变异的63.4%，且大部分基因与碳水化合物代谢和转运相关。Roehe等对72头肉牛进行研究发现，49个微生物基因与饲料转化效率密切相关，解释了88.3%的变异，其中TSTA3和FucI都参与了有助于维持黏膜屏障完整性的岩藻糖代谢。Delgado等对15头高饲料转化效率和15头低效率荷斯坦奶牛进行宏基因组测序发现，高饲料转化效率奶牛中拟杆菌门、普雷沃菌丰度较高，甲烷杆菌（Methanobacteria）、甲烷短杆菌（Methanobrevibacter）丰度较低。宏基因组组装的序列重叠群（contig）以0.19的准确度预测饲料转化效率，其基因主要参与脂肪酸和纤维素代谢途径。Xue等对9头高饲料转化效率和9头低饲料转化效率荷斯坦奶牛进行宏基因组、宏转录组和代谢组研究发现，在高饲料转化效率奶牛中硒单胞菌（Selenomonas）、牛硒单胞菌（Selenomonas bovis）丰度较高，甲烷短杆菌、厚壁菌门的1个未分类的属和3个未分类的种丰度显著较低，但其相对丰度都大于0.5%；联合分析发现6种瘤胃代谢物在微生物——代谢物互作起关键作用，可以预测奶牛饲料转化效率。总结发现，与饲料转化效率相关的微生物、微生物基因、重叠群、功能和代谢物，可以预测并选择高饲料转化效率的奶牛。
小结
瘤胃微生物种类丰富，利用宏基因组技术可以鉴定更多的微生物种类及其丰度。研究表明瘤胃微生物通过所合成的酶类及代谢通路可以影响奶牛的产奶性状和饲料转化效率，鉴定关键微生物及功能分析可以解析瘤胃微生物对奶牛的生长发育和重要性状的调控机制。但是，目前的瘤胃宏基因组研究仍不够系统深入，未来的研究需要更细致的试验设计与多组学数据联合分析，培养分离实验验证微生物与底物、微生物间如何互作，以及通过饲养实验验证微生物制剂对奶牛重要性状的影响。
（作者单位：中国农业大学动物科学技术学院）