□薛永康 张震 李静茹 孙贝贝 鲁晓娜 闫磊
犊牛腹泻具有较高的感染率和高死亡率，临床上治愈率低，给牧场带来较大的损失。隐孢子虫则是世界上引起动物和人类腹泻的最常见的寄生性原虫之一。到目前为止，已报道的有效虫种有30多个。犊牛是隐孢子虫的主要宿主，有4种隐孢子虫在腹泻牛粪便中常检出，分别是安氏隐孢子虫（Cryptosporidium Andersoni，C.andersoni）、瑞氏隐孢子虫（Cryptosporidium ryanae，C.ryanae）、牛隐孢子虫（Cryptosporidium bovis，C.bovis）和微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum，C.parvum）。
不同阶段的牛感染隐孢子虫类型也有差异。微小隐孢子虫感染犊牛后，通常是无症状的，也可能发展为严重的脱水腹泻，是犊牛腹泻的重要因素，也是一种潜在的人畜共患病虫种。本研究通过采样检测河南省内犊牛腹泻隐孢子虫种类分布，旨在为河南省隐孢子虫导致的犊牛腹泻防控提供参考资料。
材料
1、试验样品
采用直肠取样法，采集3日龄到6月龄的犊牛粪便样品，同时记录牛只的其他相关信息。共收集腹泻症状犊牛粪便样品153份和非腹泻症状犊牛粪便样品65份。
2、主要试剂
琼脂糖（批号为A8201）、50×TAE缓冲液（批号为20200309），购自北京索莱宝；无水乙醇（批号为20160719），购自上海沃凯生物；DNA分子量标准（货号为DS2000）、2×PCR MIX（批号为20190507），购自广州东盛；异丙醇（批号为20180727），购自天津市大茂化学试剂厂；Glv病毒DNA/RNA提取试剂盒，购自上海基灵。
3、主要仪器
电泳仪（型号为DYY-10C），购自北京市六一仪器厂；净化工作台（型号为SW-CJ-1D），购自苏州净化设备有限公司；Laboratory centrifuge（型号为Sigma 1-14），购自德国SIGMA实验室离心机股份有限公司；PCR仪（型号为ABI Veriti 96），购自美国应用生物系统公司；快速混匀器（型号为SZ1），购自金坛市晶玻实验仪器厂；超低温冰箱（型号为DW-88L728J），购自青岛海尔特种电器有限公司；冰箱（型号为BCD-332W），购自西门子股份公司；凝胶成像仪（型号为FluorChem E），购自美国Protein Sipmle公司；核酸提取仪（型号为Excycle-EP），购自上海基灵。
方法
1、样品DNA提取
样品到实验室后，使用快速混匀器振荡5分钟（如果样品比较浓稠可以1:1添加生理盐水稀释）。将样品冻融1次（-20℃冷冻0.5小时，然后室温解冻）。使用Excycle-EP核酸提取仪进行样品基因组提取。提取后，-20℃暂存，用作DNA扩增。
2、隐孢子虫种类鉴定
对隐孢子虫种的18 rRNA （SSUrRNA）进行基因序列分析，使用引物进行PCR扩增（微小隐孢子虫阳性及阴性对照参照IDEXX隐孢子虫ELISA试剂盒检测结果）。
3、隐孢子虫SSU基因PCR扩增
隐孢子虫SSU基因PCR扩增分两轮进行。第一轮反应：按照表1进行配液，按照表2进行第一轮反应。第二轮反应：用去离子水对第一轮扩增产物进行10倍稀释，充分振荡，用作第二轮反应模板。第二轮PCR反应体系也按照表1配制，按照表2进行第二轮反应，每个样品扩增3个平行。
4、DNA序列分析
所有阳性样品PCR产物均使用SanPrep柱DNA凝胶提取试剂盒纯化，并使用ABI 3730（Applied Biosystems）自动测序仪测序。用二次PCR引物对两个方向进行测序，证实了测序的准确性。分别使用EditSeq5.0和Chromas1.62程序查看原始核苷酸序列和正向和反向的色谱图。使用ClustalX（ClustalX 2.1）软件对核苷酸序列进行排列和分析。然后使用基本的本地对齐搜索工具，将同源序列与GenBank中的同源序列进行比较，确定隐孢子虫的种类。
5、数据的统计分析
根据隐孢子虫种类、年龄组的不同，比较隐孢子虫感染在腹泻和非腹泻犊牛中的流行情况。变量之间的关系使用χ2检验分析，P＜0.05时被认为是差异显著的。使用SPSS软件进行统计分析（V.22）。
结果
1、犊牛隐孢子虫检出情况
在14个牧场收集的153份腹泻犊牛粪便样品中，有45份（29.4%）隐孢子虫阳性，场内感染率从0.0%（0/4）到63.6%（7/11）不等。牧场1隐孢子虫感染率最高，为63.6%，牧场4、牧场6、牧场7、牧场12感染率最低，为0%（χ2=93.26，P＜0.005，牧场1和牧场4、6、7、12之间差异显著）。14个牧场65份非腹泻样品检出15份隐孢子虫阳性，感染率为23.1%。
2、隐孢子虫种类在牧场和年龄上的分布
对153头腹泻犊牛的45份隐孢子虫阳性样本进行测序，分别为C.parvum、C.bovis、C.ryanae和C.andersoni。除了C.ryanae，其他三种在腹泻和非腹泻样品中均有检出。在14个牧场的腹泻样本中，22例为C.parvum，12例为C.bovis，6例为C.ryanae，5例为C.andersoni。此外，在14个牧场65份非腹泻样品中检出C.andersoni（n=11）、C.bovis（n=3）和C.parvum（n=1）。在所调查的腹泻和非腹泻样品中均未发现混合感染的现象。
本次研究中，在腹泻犊牛隐孢子虫感染率最高的牧场1中发现，C.bovis 为优势种，占该牧场隐孢子虫感染的85.7%；C.ryanae占隐孢子虫感染率的14.3%。在牧场1、牧场2、牧场10，仅在腹泻犊牛粪便中检出隐孢子虫感染。在牧场12中，隐孢子虫感染仅在非腹泻犊牛粪便中检测到。调查发现，C.parvum 和C.bovis是14个牧场的两个优势虫种，分别占隐孢子虫阳性腹泻样本的48.9%和26.7%。50%的牧场中均检出C.parvum。
腹泻牛的种群分布与年龄有关。在1周—1月龄时感染率最高，达58.3%（14/24），4—6月龄时感染率最低，为10.3%（3/29）。C.ryanae普遍在1周—1月龄检出，C.andersoni在1—2月龄时检出率较高，而C.parvum则在2个月龄以下时检出率高。与其他三种类型相比，C.andersoni的检出率随年龄增加而增加。
在腹泻和非腹泻牛之间，隐孢子虫感染率差异不显著（χ2=3.66，P＞0.05），C.bovis的感染率也不显著（χ2=0.81，P＞0.05）。然而，C.parvum和C.ryanae的感染率在腹泻和非腹泻牛之间差异显著（χ2=12.10，χ2=4，P＜0.05）。在4种隐孢子虫中，C.andersoni在腹泻牛中的检出率低于非腹泻牛，其他3个隐孢子虫类型在非腹泻牛中检出率低于腹泻牛（χ2=6.45，P＜0.05）。
讨论
隐孢子虫于1971年首次从腹泻牛只上分离出来。此后，不同国家和地区相继出现了关于隐孢子虫病的报道。本研究系统调查了河南省奶牛腹泻病隐孢子虫种类及分型，发现14个牧场的153头腹泻犊牛粪便样本中有45个隐孢子虫呈阳性。
本研究中腹泻犊牛粪便样品的隐孢子虫总感染率为29.4%，高于宁夏（20.7%，251/1215）、山西（20.3%，52/258）、黑龙江（5.3%，27/507）及波兰（17%，119/700）的感染率，但低于马来西亚的感染率（36%，18/50）。在本研究中发现非腹泻牛只感染隐孢子虫，这与先前的相关报道一致。非腹泻牛只隐孢子虫的检出率为23.1%（15/65），高于中国西部地区（4.0%，22/545），低于青海省（24.2%，142/586）的检出率。隐孢子虫病在各地区的流行性存在一定的差异，造成差异的因素有很多，例如研究方法的区别、研究动物年龄的不同、样本量的大小、取样时宿主健康状况、取样时间和季节性以及牧场的生态条件的区别等。
迄今为止，C.parvum、C.andersoni、C.bovis和C.ryanae是牛中最常见的4种隐孢子虫类型。在目前的研究中，在14个牧场的腹泻牛中，C.parvum是检出最多的隐孢子虫种类。同样，新疆和宁夏的研究结果也是如此。原被鉴定为鹿状隐孢子虫的C.ryanae与C.parvum和C.bovis相似，但较小。C.ryanae感染也与腹泻有关，在本研究中，C.ryanae仅在有腹泻的牛中发现。
在12份非腹泻样品中也检测到了C.parvum、C.andersoni、C.bovis。但是这些牛并没有腹泻。这可能是因为隐孢子虫作为一种机会致病性寄生虫，免疫反应在牛腹泻中起着重要作用。更重要的是，牛隐孢子虫亚临床感染不应被忽视，其不但会引起奶牛体况下降 ，还会引起慢性胃炎，导致奶牛饲料利用率下降和产奶量下降。
之前的研究表明，牛隐孢子虫种类与年龄有关。C.parvum常出现在断奶前期（＜2月龄），C.bovis和C.ryanae经常出现在断奶后犊牛，C.andersoni经常在成年牛中被发现。但在一些研究中，在断奶的犊牛中，C.bovis、C.ryanae、C.andersoni也有检出。本研究分析了C.parvum、C.andersoni和C.bovis3种隐孢子虫种类与腹泻犊牛年龄的相关性以及在不同年龄段的分布。
结论
关于河南省犊牛腹泻病原隐孢子虫的流行病学研究表明，隐孢子虫属在犊牛腹泻中起重要作用，其中微小隐孢子虫是优势种。考虑到微小隐孢子虫部分亚型可能存在人畜共患风险，需要加强预防和持续监测隐孢子虫病。同时，亚临床隐孢子虫感染也不容忽视。
（薛永康 李静茹 孙贝贝 鲁晓娜 闫磊单位：河南省奶牛生产性能测定中心；张震单位：河南省种业发展中心）