□丁丽艳（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院）

奶牛体外受精技术是指奶牛的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。奶牛体外受精技术是继奶牛人工授精、胚胎移植技术之后的第三次革命，可用于研究奶牛配子发生、受精和胚胎早期发育机理，它还是奶牛胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等技术不可或缺的组成部分，随着研究的进一步深人，奶牛体外受精技术对于良种奶牛品种的后代续繁及品种资源保存等均有重大的现实意义和应用前景。

精子的获能处理

在母体内，精子只有经过获能教程才具备受精能力，即将精子的质膜蛋白去掉，改变质膜的稳定性和通透性，诱发钙离子内流及头部PH的升高，使精子体外获能。牛的精子常用化学药物诱导获能，诱导获能的添加成分常用肝素、咖啡因和PHE。

1、肝素处理法

牛精子体内获能的活性物质是存在于发情期输卵管液中的氨基多糖，可促进精子对钙离子的吸收，从而诱发顶体反应，氨基多糖诱发精子体外获能有赖于其硫酸化，肝素是硫酸化程度最高的氨基多糖，作用最强，肝素浓度以10g/mL—20g/mL，处理时间5—60分钟为最宜。

2、咖啡因处理法

咖啡因主要是通过作用于环腺普酸酶，进而调控精子内的环磷酸腺苷水平，增强精子活力。一般牛添加咖啡因的浓度为2mmol/L—10mmol/L效果最佳。可以与肝素配合应用。

3、PHE处理法

PHE是由几种成分混合而成，其中包括青霉胺、亚牛磺酸和肾上腺素，可有效增强精子的活力和穿透力，一般添加量为5μmol/L—10μmol/L。

精子获能的判定

精子获能后代谢量增加，尤其是呼吸能量增加明显，氧摄入量增加2—4倍，超活化运动，发生顶体反应。主要是在显微镜下观察精子运动形式的变化来确定精子是否获能。精子开始获能时，运动非常活跃，尾部振幅大而有力，获能后精子由直线前进变为激烈的曲线运动（鞭打状），即超活化，其特征为头部侧向曲线运动，鞭打幅度加宽和沿星状自旅轨道运动。

受精

即获能精子与成熟卵子的共培养，精子和卵子一般在获能液中完成受精过程。培养条件为38.5℃、5%CO2、100%饱和湿度，受精培养时间与获能方法有关，在BO液中一般为10—12小时，用TALP或SF液作受精液时，可培养18—24小时。精子和卵子在小滴中共培养，一般受精时精子密度为1—9×10^6个/mL，每10μL液滴放入1—2枚卵子，一般小滴体积为50μL—200μL。一般受精液中加入卵丘细胞，受精效果较好。

平衡TL-Hepes液的离心管、受精用培养皿、覆盖矿物油的微滴等，提前半小时放置于CO2培养箱中预热。

用移液枪头吹打培养成熟的卵母细胞，使外围卵丘细胞变得松散后，再用检卵针将卵母细胞移至TL-Hepes液清洗后，再用IVF液清洗，然后移至受精微滴中培养完成受精过程。

共培养一定时间（根据受精液而决定）后，在显微镜下观察，雌雄原核出现，有第2极体排出，即为受精。

（本文由黑龙江省奶业协会供稿）