牛结节性皮肤病是由牛结节性皮肤病病毒引起的牛和野生动物的经济型传染病，现如今已成为一种新兴的跨界动物疫病。目前，牛结节性皮肤病无特效药，疫苗免疫是防控该病的唯一经济有效途径。根据牛结节性皮肤病疫苗的发展历程，本文概述了弱毒活疫苗、灭活疫苗、重组疫苗的使用情况和研究进展，旨在为研制安全有效的牛结节性皮肤病疫苗及疫病防控提供新思路。
□何菊 罗元宇
牛结节性皮肤病（Lumpy skin disease，LSD）是由牛结节性皮肤病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）引起的急性、亚急性传染病，牛是主要宿主。该病主要通过吸血昆虫媒介传播，潜伏期3—12天，以皮肤、黏膜上出现大小不一的结节为主要特征，严重程度取决于毒株毒力和宿主易感性。LSD发病率在5%—45%之间，死亡率不足10%。尽管LSD病死率较低，但皮肤结节坏死导致兽皮质量下降、奶牛产奶量减少、孕畜流产、公畜不育和严重的继发性感染，对养牛生产具有严重影响。
LSD最早于1929年在非洲赞比亚被发现，此后在非洲地区国家流行，2012年以来蔓延至东南欧、中东和南亚地区，东南亚国家尤其严重。2019年，在我国新疆首次发现一株LSDV，现已传播至我国多个省份并引发严重疫情，经比对该毒株可能来自越南。依据我国动物防疫法规定，LSD被暂列为二类动物疫病。
目前，LSD无特效药，在疫病流行区或禁止扑杀牛只的国家，疫苗免疫是防控LSD唯一经济可行的手段，因而生产安全有效的疫苗是极为迫切的。目前国内仍无商品化LSD疫苗，国外市售疫苗产品在有效性、安全性和副作用等方面各不相同。本文主要概述了近年来LSD弱毒活疫苗、灭活疫苗、重组疫苗的使用情况和研究进展，旨在为LSD安全高效疫苗的研制和疫病防控提供新思路。
病原学
LSDV属痘病毒科（Poxviridae）脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）羊痘病毒属（Capripoxvirus），同属病毒有羊痘病毒（Sheeppox virus，SPPV）和山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）。LSDV是一种有包膜的双链DNA病毒，病毒粒子呈椭圆形，直径300—350纳米，基因组长约151kb，由中心编码区和两翼2.4kb的反向末端重复序列组成，可编码156个假定基因，比该属的其他两种病毒多出9个基因。庞大的基因组使得病毒对恶劣环境有很强的抵抗力。LSDV经典野生型菌株分为两大支系，分别是南非分离株Neethling（1.1系）和肯桑尼亚分离株KSGP-180/240（1.2系），这两个分支的菌株基因组序列存在一定差异，但无临床差异。LSDV具有较高的遗传稳定性，但最新发现，长期流行1.2系的印度出现1.1系的突变体，表明LSDV的遗传组成正在发生变化。
疫苗研究
1、弱毒活疫苗
弱毒活疫苗是指将保持良好免疫原性和遗传特性的毒株经过物理、化学或生物处理，产生对原宿主致病性减弱的疫苗株，传统方法为连续传代致弱。SPPV与LSDV因具有抗原同源性可产生交叉保护作用，早在20世纪90年代，埃及使用针对罗马尼亚羊痘病毒株的疫苗控制了LSD的爆发。截至目前，基于羊痘病毒的疫苗已广泛用于LSD的防控并取得一定成效。根据《牛结节性皮肤病防治技术规范》要求，我国受疫情威胁区县采用山羊痘弱毒活疫苗并按山羊5倍剂量免疫。
现国外有两类市售预防LSD的弱毒活疫苗，一类是基于LSDV Neethling株、KSGP-180/240株的同源疫苗，另一类是基于GTPV（Kedong株、Gorgan株、G20-LKV株和AV41株）、SPPV（YugoslavianRM65株、Bakirköy株和Romanian株）的异源疫苗。在疫苗接种策略方面，不管是同源疫苗还是异源疫苗，绝大部分具有良好的临床保护效果，仅少数疫苗保护作用较差，如在肯尼亚制备的KSGP-180疫苗株不能对牛提供LSDV保护。常用的LSDV同源疫苗制品主要包括Neethling（Onderstepoort生物制品公司）、Herbivac LS（Deltamune）和Lumpyvax（MSD动物保健公司）。临床试验表明这几种疫苗可引起机体不同局部反应并伴有发热，但对各组免疫动物的采食量、日常活动和总体健康均无负面影响，是防控LSD的有效疫苗。作为LSDV最具代表性的毒株，Neethling毒株是1943年在博茨瓦纳和1945年在南非爆发LSD的真正病原体，后来被纯化并命名为Neethling型。1968年，Weiss将Neethling野毒株在羔羊肾细胞中连续传代60次后，改用鸡胚尿囊膜连续传代至第20代，首次获得Neethling弱毒疫苗株，免疫评价表明该疫苗可对牛产生长达3年以上的保护作用。最近，印度通过连续传代毒力减弱的方法获得一株LSDV弱毒活疫苗Lumpi-ProVacInd，该疫苗可以诱导产生强效抗体并刺激细胞介导的免疫反应。大型临床试验表明，该疫苗在牛、水牛和孕畜中是安全的，已在亚洲商业化使用。众所周知，弱毒活疫苗存在一定潜在风险。如机体的过敏反应、疫苗本身可能发生返祖现象和产生重组病毒。鉴于弱毒活疫苗存在的不足，同时使用弱毒活疫苗还可能使无羊痘国家失去无病状态，因此，研究开发安全有效的替代疫苗是有必要的。
2、灭活疫苗
灭活疫苗安全且有效，是当前的研究热点。疫苗佐剂可以有效增强灭活疫苗的效果，在灭活疫苗的使用和临床研究中被广泛应用，一些关于LSD灭活疫苗的研究已经发表。
Hamdi等人研制了一种以Neethling毒株为基础的油佐剂灭活疫苗，临床试验结果表明，从接种后第7天开始产生高水平的特异性抗体，其滴度与活疫苗相似，无不良反应，诱导免疫保护作用可持续长达一年时间，有望作为活疫苗更安全的替代品。Wolff等人发现低分子量共聚物佐剂疫苗制剂能够诱导CaPV感染动物的保护性免疫。随后该团队用低分子量共聚物佐剂与灭活塞尔维亚LSDV疫苗结合，发现即使用最低剂量，接种疫苗的牛没有出现病毒血症或病毒脱落，能够提供完全的临床保护。该项研究表明低分子量共聚物佐剂对灭活疫苗保护水平有显著影响，在灭活疫苗的研发中具有较大的潜力。Es-Sadeqy等人的一项研究也显示接种加入佐剂低分子量共聚物的灭活疫苗可保护动物免受野毒攻击，保护率为100%，免疫动物无不良反应。由于LSD和蓝舌病（Bluetongue，BT）是反刍动物主要的病毒性媒介传播疾病，Es-Sadeqy等人又基于LSDV Neethling株和BT V4株开发了一种针对这两种疾病的灭活油佐剂二价疫苗。在之后的一年时间里，将该疫苗在牛身上进行安全性和免疫原性测试，并通过病毒中和试验（Virus neutralization test，VNT）和酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）监测疫苗免疫效果。结果显示，该疫苗是完全安全的，从第二次注射后的一年内都会产生高中和抗体。Matsiela等人用低浓度的二亚胺（Binary ethyleneimine，BEI）灭活Neethling菌株，以Montanide™Gel-01PR作为疫苗佐剂，免疫家兔获得高水平的中和抗体，但该疫苗需要在牛身上做进一步研究。与弱毒活疫苗相比，灭活疫苗具有生产成本低、开发周期短、安全性高等优点，但灭活疫苗通常需要加强免疫以防止病毒入侵。
3、重组疫苗
弱毒活疫苗曾被认为是最理想的疫苗，它能保留所有病毒相关抗原，且病原体能在宿主体内复制，不断刺激宿主的天然免疫。不幸的是，即使病毒毒力被降低，也存在恢复的可能。为了解决这些问题，研究人员筛选、鉴定出影响病毒毒力的基因，试图通过定点突变或敲除这些毒力基因来减弱病原体的毒力，从而获得弱毒疫苗株。
靶向敲除毒力基因的方法已被用于制造LSDV重组疫苗。Romero 通过同源重组敲除牛瘟病毒（Rinderpest virus，RPV）胸苷激酶基因，与牛瘟病毒融合蛋白（F）基因重组，制备表达RPV F蛋白的重组LSDV疫苗，可有效保护接种奶牛免受RPV和LSD的威胁。已证实利用基因敲除（KO）技术去除南非LSDV Warmbaths株的免疫调节因子白介素10样基因（IL-10）005，构建重组体LSDV WB005KO，可保护绵羊和山羊免受强毒攻击，且未观察到临床疾病和病毒血症。该项研究还发现接种疫苗能有效刺激细胞免疫进而介导干扰素-γ基因（IFN-γ）分泌。Kara等人分别敲除LSDV的两个免疫调节基因005和008，获得的重组疫苗在牛身上进行了安全性、免疫原性和保护性评估，结果显示LSDV仍具有较强毒性，接种这两种疫苗的动物均观察到严重的疫苗接种后反应和发热反应，说明WB005KO对牛不具有同等保护作用，008缺失影响病毒毒力。同时敲除LSDV的005、008、066和142基因后病毒仍具有免疫原性，且产生的候选疫苗LSDV Atyrau-5BJN（IL18）是安全的。对Herbivac LS毒株第008批次的疫苗株进行测序，发现其超氧化物歧化酶（SOD）同源蛋白比Neethling疫苗株短，推测SOD蛋白可能与病毒毒力有关，SOD蛋白的存在影响疫苗的免疫原性。Douglass等人构建了LSDV Neethling株 SOD同源敲除重组和敲入重组体，将其与亲本毒株比较发现，SOD基因缺失抑制了病毒在MDBK细胞和鸡胚尿囊膜（chick chorioallantoic membranes，CAMs）上的生长。此外，活检显示SOD基因缺失可减轻炎症反应，但组织病变更严重、坏死较多。表明缺失SOD可能产生毒力降低而免疫原性提高的nLSDV，故该候选疫苗还需进一步试验。由于重组疫苗具有复制感染能力，释放到环境中也可能对动物安全构成威胁，有研究者指出研制具有复制缺陷的重组病毒是解决这项问题的方法，这为开发安全有效的重组疫苗提供了新思路。
小结和展望
目前，LSD疫苗研究仍在持续开展，基于不同类型疫苗的优缺点，研发多类型的高效疫苗是必要的。目前，灭活疫苗在LSD流行地区大规模使用并取得明显成效，但仍存在疫苗株感染、保护效果较差等问题。临床研究表明，在生产弱毒活疫苗时应准确把握毒力衰减程度，衰减不足会引起过度局部免疫反应，严重时会引发病症；过度衰减则会导致免疫反应不足或诱发继发性感染。因此，为达到预期的免疫效果，在疫苗生产中，应充分评价疫苗的有效性和安全性；在临床应用时，需具体分析问题，确保精准免疫。由于灭活疫苗抗原性较低，至今仍未研发出安全有效的灭活疫苗，但相信在研究人员的不懈努力下，找到显著提高灭活疫苗保护性的免疫佐剂，研发安全有效的灭活疫苗是值得期待的。就重组疫苗而言，随着基因工程技术的不断发展，靶向敲除毒力基因将成为获得具有复制缺陷的安全有效重组疫苗株的重要手段。此外，联合疫苗、基因工程疫苗正成为研究热点。免疫信息学方法可最大限度地减少过敏原性和同源性，同时最大限度地提高免疫原性。生物信息学是疫苗研发的良好工具。利用免疫信息学方法筛选出早期与宿主细胞相互作用的重要病毒蛋白，进一步分析B细胞和T细胞特异性表位，选择过敏原性低、毒力小、免疫原性高等特性的优势特异性表位，构建基于mRNA的LSDV候选疫苗，使该疫苗具有较高的免疫原性，可作为弱毒活疫苗的有效替代方案。最近，Breman等人发现，在LSDV基因组的5'和3'端，有三个高度可变区，编码了参与病毒免疫反应的基因，这为进一步研究新型疫苗提供了一个新起点。
根据天花病毒（Smallpox virus，SPV）消除经验，预防和消除LSD最终取决于安全高效疫苗的大规模使用，而开发能区分疫苗免疫还是野毒感染（Differentiation between infected and vaccinated animals，DIVA）的新型疫苗是极为关键的。LSD在全球持续爆发、流行以及LSDV宿主范围的不断扩大和高致命性毒株的产生，说明目前对LSDV的研究仍有大量空白，应加强其病原学、生态学、流行病学、免疫机制等方面的研究，为开发DIVA新型疫苗奠定基础。
（何菊单位：贵州省六盘水市水城区动物疫病预防控制中心；罗元宇单位：贵州省六盘水市农业科学研究院）