□张保海 黄琼 杨彩虹 李珂珂
何妍萍 王吉成 姚学萍 曹随忠
奶牛乳房炎是奶牛养殖中造成经济损失最严重的疾病之一，通常是由病原微生物刺激乳腺组织而引起的一系列炎症反应，根据奶牛在生产中是否有乳房红肿、乳汁异常等症状，将奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎；根据病原菌寄生的环境及传播途径，又将奶牛乳房炎分为环境性乳房炎和传染性乳房炎。目前临床设计的疫苗主要针对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等奶牛乳房炎常见致病菌，还有一些病原菌虽感染率低，但往往也能引发较为严重的炎症。目前乳房炎疫苗种类多为弱毒疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和荚膜多糖-蛋白偶联疫苗等，但多数疫苗仅停留在临床试验阶段，能够大范围推广应用的商品化疫苗还较为欠缺，亟须科研人员研究解决。
疫苗研究进展
1.大肠杆菌疫苗
大肠杆菌属革兰氏阴性菌，兼性厌氧菌，广泛存在于人和动物的肠道，自然环境中也存在一定数量的菌群，其常见抗原有O、K、H。田崇瑜等构建大肠杆菌基因缺失灭活苗，免疫小鼠后采集血清测定抗体效价，并根据抗体水平将小鼠分组后用大肠杆菌强毒株进行攻毒，达到最低保护力抗体水平。经对奶牛皮下注射此疫苗，与对照组相比，均可产生一定的保护力。Liu等构建大肠杆菌外膜蛋白A纳米颗粒（NP-OmpA）疫苗，对小鼠进行口服免疫后，通过肝脏和肾脏病理切片评估疫苗的安全性，使用qRT-PCR检测（一种分子生物学技术）免疫相关基因表达，ELISA（酶联免疫吸附试验）检测抗血清滴度，结果显示NP-OmpAs对小鼠肝脏和肾脏是安全的，抗血清滴度显示该疫苗对大肠杆菌具有免疫识别作用。Quiroga等利用奶牛乳腺炎源大肠杆菌蛋白脂质体构建疫苗，对小鼠皮下接种疫苗，接种后雌性交配，产后5—8天用大肠杆菌感染，感染2天后切下小鼠乳房，评估疫苗的有效性、安全性以及产生的免疫反应，结果显示与未接种疫苗的动物相比，接种疫苗的小鼠表现出轻微的临床症状和较低的乳腺细菌载量。与对照组相比，疫苗接种诱导血液和乳腺中针对大肠杆菌的IgG、IgG1和IgG2a（免疫球蛋白）水平升高，显示出较少的炎症浸润和组织损伤，证明疫苗安全有效。还有研究表明大肠杆菌疫苗利用纳米颗粒与脂质体技术，可使疫苗抗原递送效率提升3—5倍。如NP-OmpA纳米颗粒通过20—50纳米的粒径优化，实现了口服后肠道黏膜的高效摄取，蛋白脂质体则通过模拟细菌膜结构，增强了抗原呈递细胞的识别效率。通过多表位嵌合策略、优化佐剂等方法可以有效提升疫苗的抗体水平。
2.金黄色葡萄球菌疫苗
金黄色葡萄球菌属革兰氏阳性菌，呈葡萄串状排列，常常通过皮肤和口咽部侵入机体，定植于乳腺上皮细胞，当奶牛的乳腺组织遭受损伤时，会引发隐性或慢性乳房炎。金黄色葡萄球菌有多个毒力因子，包括荚膜多糖、黏附素等，这些毒力因子在金黄色葡萄球菌入侵机体细胞过程中起到关键作用，同时也是疫苗开发的候选抗原。Bea等选择金黄色葡萄球菌铁代谢相关的脂蛋白（SitC）作为候选抗原，设计了能引起B细胞和T细胞表达的序列，构建了C端带有蛋白纯化的氨基酸、N端带有佐剂的虚拟疫苗，通过ProtParam（蛋白质参数分析工具）预测疫苗构建体的理化性质和免疫特性并进行评估比较，得到疫苗可增加免疫细胞群和细胞因子的反应结果。不同脂蛋白候选抗原疫苗构建体具有相似的理化和免疫学特性，但显示出不同的免疫应答。韩先乐等利用金黄色葡萄球菌Trap蛋白基因构建表达质粒，经体外诱导表达后纯化，与弗氏佐剂混合制备疫苗，对小鼠进行肌肉免疫后检测细胞因子和测定血清抗体，结果表明小鼠产生了细胞免疫和体液免疫。二免后使用原毒株攻毒，做器官组织涂片和病理切片，检测到细菌对小鼠器官的损伤和定值显著低于空白组。Soltan等利用金黄色葡萄球菌分泌蛋白磷脂酰肌醇磷酸二酯酶（Plc），设计了Plc蛋白的抗原表位，经体外诱导表达验证了其免疫原性，在注射免疫小鼠试验中也验证了疫苗的保护有效性。以上研究表明，通过反向疫苗筛选保护抗原，可以提高抗原设计的精准性，提高抗原表位覆盖度。
3.链球菌疫苗
引起奶牛乳房炎的链球菌主要包括无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和化脓链球菌，系革兰氏阳性菌，其中无乳链球菌是奶牛乳房炎的重要病原菌，也是人兽共患病病原，可引发新生儿和鱼类败血症、脑膜炎等。李松建等构建了由IgG.FcRn（一个关键生物学机制）介导无乳链球菌保护性表面抗原蛋白（Sip）的融合蛋白Fc-Sip，并与佐剂混合制成Fc-Sip亚单位疫苗，经免疫干奶前15天奶牛，对比免疫前后乳中细菌数、测定血清抗体滴度验证了疫苗具有降低乳中体细胞数的作用，并促进奶牛免疫反应。无乳链球菌疫苗研究较多的还有荚膜多糖疫苗、荚膜多糖结合疫苗和蛋白疫苗，但目前都在临床试验阶段，还没有应用到生产上。杨启昱等、王汉青等分别构建了无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌3-磷酸甘油醛脱氢酶（GapC）蛋白，通过免疫小鼠后测定IgG抗体水平、预测筛选抗原表位。经验证其具有较好的抗原性，对小鼠的免疫保护率高达76%，未来可作为制备亚单位疫苗的候选抗原。以上研究以GapC、Sip等保守蛋白为核心，整合Sip的α-螺旋结构域与GapC的酶活性中心表位，构建多价亚单位疫苗，预计可覆盖90%以上奶牛源链球菌血清型。基于FcRn（新生儿FC受体）介导的抗原递呈，未来可设计“双功能融合蛋白”N端融合链球菌表面蛋白（如Sip），以及C端融合TLR4（机体免疫系统中一种重要的模式识别受体）激动剂（如脂多糖类似物），实现“抗原递送——模式识别受体激活”的协同效应。
4.其他疫苗
除了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及链球菌等常见致病菌外，还有一些病原菌也可引起奶牛乳房炎，如克雷伯氏菌、化脓棒状杆菌及支原体等。这些病原菌虽在乳房炎病例中占比相对较小，但一旦感染往往会引发较为严重的炎症反应，对奶牛的健康和生产性能造成不同影响，进而给养殖户带来经济损失。对于这类病原菌的疫苗研究，目前国内外仅部分处于试验研究阶段。崔琦使用从乳样中分离的克雷伯氏菌MrkD基因构建重组质粒，并在体外诱导表达，在MrkD蛋白与奶牛乳腺上皮细胞作用后，用克雷伯氏菌进行黏附，经对奶牛上皮细胞进行间接免疫荧光检测后发现克雷伯氏菌黏附显著降低，从而为探究重组蛋白疫苗对细菌的黏附性提供重要参考。目前支原体疫苗几乎都是灭活疫苗，加入完全弗氏佐剂并免疫奶牛后，与对照组相比，虽然免疫效果不显著，但感染后病程时间显著缩短，对预防炎症有一定的作用。未来，可进一步探索基因工程、合成生物学等前沿技术在疫苗研发中的深入应用，如对克雷伯氏菌还可挖掘更多关键抗原基因，优化重组蛋白疫苗设计，针对化脓棒状杆菌和支原体，尝试开发多联多价疫苗以提高疫苗广谱性，同时探索新型佐剂和免疫增强剂与现有疫苗的协同作用，提升疫苗免疫效果，为奶牛乳房炎的防控提供更多解决方案。
近年来，研究人员发现引起奶牛乳房炎的病原往往不是单一菌株，而是存在多种病原体共同感染，单价疫苗往往已经不能够满足生产需求，新的多价疫苗研究方向也随之显现。Shah等制备牛源性金黄色葡萄球菌、结节性链球菌和大肠杆菌多价灭活疫苗，与不同佐剂混合后对小鼠、兔、犊牛进行肌肉注射免疫，同时攻毒验证疫苗保护力，结果显示注射疫苗的小鼠和兔存活率明显更高，血清抗体效价显示在兔体内引发体液免疫。牟小青等制备牛源无乳链球菌和金黄色葡萄球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗，用不同浓度免疫小鼠，结果显示结合疫苗免疫效果显著高于单一疫苗。
小结与展望
引起奶牛乳房炎的病原微生物种类繁多，临床型乳房炎往往都是多种病原菌共同作用的结果，生产中大多采用抗菌药物进行治疗，但抗菌药物的不当使用会造成细菌耐药，进而引发公共卫生安全。目前，国外已经有可用于奶牛乳房炎防控的商品化疫苗，但国内针对奶牛乳房炎的疫苗大多还停留在临床试验阶段，缺少真正可用于实际生产的商品化疫苗。随着研究的深入，未来的疫苗研究不仅仅是针对某一个病原菌或者一种病原菌的某一血清型，而是制备多价疫苗，或者制备组合疫苗，这样可以获得使用价值更高的疫苗。
随着构建的疫苗在宿主体内的进一步研究显示，金黄色葡萄球菌铁调节脂蛋白有助于提高对该菌引起的乳房炎的预防。在筛选疫苗候选抗原时，既要考虑候选抗原蛋白的稳定性和广泛性，还要考虑病原菌致病机理以及感染过程中某些调节蛋白发挥的作用。反向疫苗也是一种先进的方法，该方法可用于识别针对包括金黄色葡萄球菌在内的多种微生物的新候选疫苗，在针对有多个血清型等复杂情况时，利用反向疫苗可以设计出安全高效的疫苗。核酸疫苗因其工艺简单、成本较低，在以后的疫苗制备中也将发挥重要作用，如利用CRISPR-Cas9技术（一种精准的基因编辑技术）敲除无乳链球菌的荚膜多糖合成基因（如cpsE）与免疫逃逸因子（如Lmb蛋白），构建温度敏感型减毒菌株，实现在37℃乳腺组织中有限复制，可诱导长效记忆免疫（记忆B细胞存活期延长至180天）。此外开发乳腺黏膜靶向疫苗，利用壳聚糖纳米颗粒（粒径50—100纳米）负载Fc-Sip/GapC抗原（两种关键疫苗成分的组合），通过鼻腔或乳头管递送，可诱导局部IgA（免疫球蛋白A）抗体及乳腺组织驻留记忆B细胞。该系统模拟链球菌黏附素与乳腺上皮细胞受体的相互作用，使抗原在泌乳期乳腺组织滞留时间延长至96小时，可解决传统注射疫苗对黏膜感染保护不足的难题。由此可见，疫苗抗原表位的选择，制备方式，递送系统革新以及佐剂的选择，都将成为未来制备疫苗的重要参考，也将进一步提高疫苗免疫对机体的保护力。
（张保海 黄琼 杨彩虹 李珂珂 何妍萍 王吉成单位：甘肃省武威市畜牧兽医总站；姚学萍 曹随忠单位：四川农业大学动物医学院）