□丁丽艳（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院）
卵丘卵母细胞是奶牛体外受精技术的主体，奶牛卵丘卵母细胞的体外成熟技术已被广泛应用于科学研究和畜牧生产中。
卵丘卵母细胞的获得
1、从废弃的奶牛卵巢中获得
即运用切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞。将收集卵巢于25℃—35℃的生理盐水中，添加抗生素，3小时内运回实验室。将术者的手和母牛的卵巢消毒后，将卵巢上多余的肉割掉，用装有18号针头的5毫升注射器，从卵巢表面直径为2—6毫米卵泡中抽取卵母细胞，也可用消毒的手术刀片切割卵巢，回收卵母细胞。
2、应用奶牛活体采卵技术采集卵丘卵母细胞
活体采卵的方法主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。其中，超声波法借助Ｂ超采集卵母细胞，是最主要的活体卵方法之一，具体操作方法如下：
一般选择母牛发情后第3—16天采集卵母细胞，每周可采1—2次。首先将供体母牛固定在保定架内，硬膜外鞘注射2%的盐酸利多卡因2—5毫升，进行麻醉，将牛尾系向一侧，清除直肠内的宿粪，奶牛外阴清洗消毒，穿刺针安放于探头上的穿刺架内，通过管路与集卵管和真空泵相连，同时用冲卵液清洗针及管道，调整真空泵的负压为40—50毫米汞柱，将B型超声波显示器图象调整为最佳；将保温试管架温度调整到38℃。将牛阴道探头穿刺架润滑后送入母牛阴道内，一手固定卵巢，一手把握探头穿刺架，通过直肠把握法把卵巢固定在B超阴道探头前，调整卵巢和探头位置，使卵泡位于穿刺引导线上，操作者向前推动探头架上的采卵针穿刺卵泡，同时用脚踏开关启动真空泵，通过真空泵的负压将卵泡液和卵子吸入集卵管中，在收集卵子过程中集卵管保持38℃。
奶牛卵丘卵母细胞体外成熟培养
1、成熟培养液
目前，用于牛卵丘卵母细胞体外成熟的基础培养液多为TCM-199，也有的使用Ham`s F-10，MEM，TALP等培养液。
2、培养液中的添加物
血清：血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类因子，是卵丘卵母细胞体外成熟与受精所必需的物质，能有效提高牛卵丘卵母细胞的体外成熟率。随着研究的深入，人们了解到血清除了可以提供卵巢上卵泡体外生长所必需的营养物质以外，也存在抑制卵泡生长的因素。因此，近年来研究用牛血清白蛋白或白蛋白来代替血清添加到基础培养液中，起到很好的培养效果。
激素：目前，绝大多数研究者在牛卵丘卵母细胞的体外成熟培养中添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物，结果都对卵母细胞成熟起到了促进作用。培养液中添加激素能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成，并且抑制颗粒细胞的凋亡，而在无激素的培养液中卵母细胞成熟率显著降低，且退化量大大增加。
生长因子：基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子，如胰岛素、表皮生长因子、胰岛素生长因子、白血病抑制因子、转化生长因子等，对卵母细胞的生长、成熟可起到重要的调节作用。生产因子是卵母细胞成熟的诱导剂，能促进牛卵丘卵母细胞的体外成熟。
卵泡液：卵泡液能够提高成熟卵母细胞质的质量，同时，控制卵泡液在培养液中的添加浓度，可以消除其对核成熟的抑制作用。有研究表明，卵泡液对核成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关。
卵丘细胞：卵丘细胞能够增加卵母细胞内谷胱甘肽（GSH）含量，GSH具有促进精子穿卵、雄原核形成及提高组蛋白活性等功能。在卵丘细胞与卵母细胞之间存在间隙连接，一些小分子物质如离子、核酸、氨基酸等可在两者之间交换，进而促进卵母细胞成熟，卵丘细胞能促进卵母细胞体外减数分裂的恢复，并且对发生GVBD后至排出PB1也起着重要作用。
钙离子：细胞内Ca2+可以使无活性的促进因子，处于激活状态，进而促进卵母细胞的成熟分裂。
3、培养条件
气相条件：体外培养一般采用含5%CO2的空气，或5%CO2、5%O2、90%N2的气体。培养系统内CO2不仅可以平衡培养基，而且还有助于细胞代谢中的丙酮酸转换成草酰乙酸，有利于细胞成熟。
温度条件：不同的温度对卵母细胞体外成熟的影响很大，过高或过低的温度均不利于卵母细胞的体外成熟，牛卵母细胞一般采用38.5℃进行体外培养。
湿度：对于湿度的调节，一般需在CO2培养箱内放置调湿盘，以维持100%的相对湿度，防止因培养液蒸发改变培养基成分的浓度，影响PH值和渗透压。
奶牛卵丘卵母细胞体外成熟的判定
奶牛卵丘卵母细胞的成熟是涉及细胞核、细胞质、膜、卵丘细胞和透明带等成熟的复杂生物学过程。在形态上表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩形成染色体，第一极体释放，细胞器重组，以及卵丘细胞扩展、膨胀、液化和透明带软化等。
近年来研究者借助光镜和电镜逐渐揭示出这一生理生化过程的形态结构变化。由于仅有核成熟和卵丘细胞成熟能在光镜下进行判定，而对卵母细胞的综合成熟过程很难做一整体的具有生理学意义的评价，因而现在主要是以卵丘细胞扩散，并释放出第一极体作为卵母细胞体外培养成熟的判定标准。
卵丘是指在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群，卵丘对于卵母细胞成熟有极其重要的作用。主要表现在卵丘参与维持卵母细胞减数分裂阻滞，诱导卵母细胞减数分裂恢复、支持卵母细胞细胞质的成熟，卵丘形态和卵丘扩展影响卵母细胞成熟。了解卵丘在卵母细胞成熟中的作用有助于帮助人们进一步揭示奶牛卵母细胞成熟的机制。卵丘细胞就是位于卵丘的卵泡细胞，贴透明带的一层柱状呈放射状排列的卵泡细胞为放射冠，卵泡腔周边的卵泡细胞组成颗粒层，初级卵泡发育为次级卵泡时，卵母细胞渐位于卵泡的一侧，并与其周围的颗粒细胞一起突向卵泡腔，形成卵丘。
（本文由黑龙江省奶业协会供稿）